Stefan Stratimirović je rođen 26. ili 27. decembra 1757. godine u Kulpinu po starom kalendaru, odnosno 06. ili 07. januara 1758. po novom kalendaru. Osnovao je Karlovačku gimnaziju i bogosloviju i gimnaziju u Novom Sadu. Bio je poznat kao veliki protivnik jezičnih reformi Vuka Stefanovića Karadžića.
Stratimirovići su poreklom iz Hercegovine, a za vojničke zasluge od carice Marije Terezije dobili su 1745. plemstvo i imanje Kulpin. Stefan je osnovnu školu završio u Kulpinu i Begeču, a gimnaziju u Novom Sadu, Segedinu i Vacu. Studije prava započeo je 1775. godine u Budimu, a okončao ih u Beču. U Beču se družio sa čuvenim slavistom Adamom Kolarom. Tokom celoga školovanja uvek je bio najbolji đak i uvek je mnogo čitao i učio i pored onoga što je bilo obavezno da se uči.
Budimski vladika i karlovački mitropolit
U Sremske Karlovce je došao 1780. godine (ili 1783) sa ciljem da se zakaluđeri, ali pošto tada nije postojala bogoslovija privatno je učio bogoslovne nauke kod slavnoga bogoslova i istoričara arhimandrita Jovana Rajića. Primljen je za đakona 26. marta 1784, da bi 08. aprila postao arhiđakon, 10. jula jeromonah, a 26. avgusta 1784. postao je arhimandit manastira Krušedol. Međutim nije živeo u manastiru, pošto ga je mitropolit Mojsije Putnik zadržao kod sebe na dvoru. Mitropolit Putnik predložio ga je 1786. za vladiku Budimske eparhije. Predložio je još dva starija kandidata, pa je car Josif II nakon razgovora sa tri kandidata za vladiku odabrao najmlađega, tj. Stefana. Kada je umro mitropolit Mojsije Putnik na narodno-crkvenom saboru u Temišvaru izabran je 9. novembra 1790. godine za karlovačkoga mitropolita. Druga dvojica kandidata za mitropolita bila su Josif Jovanović Šakabenta i Petar Petrović. Car Leopold Drugi je potvrdio taj izbor.
Osnivanje karlovačke gimnazije i bogoslovije
Čim je postao mitropolit naročitu pažnju posvetio je obrazovanju. Zahvaljujući bogatim prilozima karlovačkoga krojača Dimitrija Anastasijevića Sabova i drugih osnovao je 1791. karlovačku gimnaziju. Karlovačka gimnazija je otvorena 1792. Ubrzo nakon toga 1794. osnovao je Karlovačku bogosloviju. Utvrdio je nastavni program i postavio učitelje. Da bi omogućio siromašnim učenicima pohađanje gimnazije i bogoslovije osnovao je 1797. fond za pomoć siromašnim učenicima, a osnovao je i dom za ishranu i stanovanje siromašnih bogoslova i gimnazijalaca. Od toga je kasnije osnovan „Stefaneum” za gimnazijalce u Sremskim Karlovcima. Njegovim zaslugama osnovana je kasnije i gimnazija u Novom Sadu.
Uredio je i popunio mitropolijsku knjižnicu u Sremskim Karlovcima. Mnogo je volio nauku i književnost i sa njima se mnogo bavio. Dopisivao se sa mnogim najvećim slovenskim naučnicima i književnicima svoga doba. Izabran je 1817. za člana Učenoga društva iz Getingena. Oko sebe je nastojao da okupi što više učenih ljudi. Pomagao je talentovanu omladinu i slao ih na studije na čuvene univerzitete. Početkom 19. veka stvorio je takvu prosvetnu atmosferu u Sremskim Karlovcima da je Jernej Kopitar pomišljao da se tu otvori prvi srpski univerzitet, koji bi se izdržavao od manastirskih imanja.
Borba protiv unijaćenja
Zaveo je red i disciplinu u crkvi. Crkvenim životom Srba upravljao je uglavnom sam, razumno i energično. Znao je da se odupire vladarima Austrije kada bi njihove želje bile suprotne interesima srpskoga naroda i crkve. Odbio je da ćirilicu zameni latinicom i da uvede gregorijanski kalendar. Tražio je 1789. godine od cara da se prekine sa unijatskom propagandom i da se prestane sa praksom davanja novčane pomoći onima sveštenicima, koji pređu u unijate. Car Franjo Prvi mu je jednom prilikom priznao da država nastoji da pounijati Srbe, jer sumnja u njih zbog veza sa pravoslavnom Rusijom, a Stratimirović mu je onda naglasio da se tih veza ne treba bojati, dok je Srbima dobro u Habzburškoj monarhiji, ali ako ne bude dobro onda bi i da su katolici mogli da traže druge saveznike.
U vreme Francuske revolucije i Prvoga srpskoga ustanka razmatrao je i ideje o oslobađanju celoga srpskoga naroda, pa je 1804. sastavio tajni Nacrt vospostavljenja nove sloveno-srpske države i predao ga ruskom dvoru. Predlagao je obnovu Srbije kao vazalne kneževine sa nekim ruskim ili luteranskim knezom. Želio je punu samostalnost Srbije, ali znao je da se najviše može dobiti autonomija u okviru Turskog carstva. Pomagao je ustanicima svojim savetima i vezama sa bečkim dvorom, što je omogućavalo da se dobije preućutna saglasnost o snabdevanju Karađorđa oružjem, municijom i hranom iz Habzburške monarhije. Održavao je veze sa ustaničkim vođama, prvenstveno sa Jakovom i Matijom Nenadovićem i Božom Grujovićem. Karađorđa je smatrao nezamenljivim, pa je druge pozivao da mu budu poslušni. Ustaničke vojvode su poštovale Stratimirovića, ali nisu uvek prihvatale njegove savete.
Odmah nakon izbijanja Ticanove bune 1807. odazvao se pozivu vlasti da utiče na smirivanje pobune. Znao je da Srbija u vreme rata sa Turcima nije sposobna da pomogne pobunu Srba u Austriji, pa je otišao u Vrdnik i tražio od seljaka da odustanu od pobune. Teodor Avramović Tican je naredio seljacima da Stratimirovića drže zarobljenog u manastiru za vreme pobune. Nakon prvoga poraza seljaka u okršaju sa vojskom mitropolit je stupio u kontakt sa više seljačkih vođa i predložio im da prihvate opštu amnestiju i dolazak carske komisije. Na taj način smirio je pobunu, a amnestiju su dobili svi sem Teodora Ticana. Po okončanju bune primio je odlikovanje od zahvalnoga cara.
Protivnik Vukove reforme
Bio je pod snažnim uticajem borbe za očuvanje pravoslavlja među Srbima i postajao je sve konzervativniji, pa je dolazio u sukob sa mnogim naprednim duhovima svoga vremena, koji su u akciji oko socijalnih reformi zahvatili i crkvena pitanja. Bio je zbog toga glavni protivnik reformi Dositeja Obradovića i Vuka Stefanovića Karadžića. Uticao je na sve prosvetne radnike oko sebe, pa je u Sremskim Karlovcima stvorio centar otpora novim idejama i reformama u srpskom društvu, ali ne samo na crkveno-prosvetnom, nego i na kulturnom polju. Sukobljavao se sa Dositejem Obradovićem zbog njegovih napisa o manastirima, sa Lukijanom Mušickim zbog ekonomisanja, a sa Vukom Karadžićem zbog Vukove reforme jezika. Stratimirović se posebno nije mirio sa Vukovom azbukom, zbog izbacivanja starih ćiriličnih slova i uvođenja slova J, smatrajući to napuštanjem pravoslavlja i pokatoličavanjem. Smatrao je da narodno-crkveni sabori obično donose više štete, nego koristi, pa nijedan sabor nije održan za 46 godina, dok je on bio mitropolit. Za sobom je ostavio velik broj naučnih i književnih sastava u rukopisima.